UniMab 50HC在抗体中的应用案例
抗体的发展
1975年杂交瘤技术的出现，标志着单克隆抗体进入发展新纪元。由于免疫原性等原因，在1975-1986年之间，只有一个针对CD3的鼠源单克隆抗体获批。随着全人源化等技术不断迭代，越来越多的抗体项目如雨后春笋般出现。截止到2019年12月，79个单抗产品在美国和欧洲被批准和销售，超过300个单抗在研发中。单抗市场预期以每年超过8%速度增长，到2025年，全球销量估计近3000亿美元（1）。以TNF-α，PD-1/L1及CTLA-4,PCSK9等靶点的单抗正如日中天 、抗体FC融合蛋白等药物有很广阔的市场前景，双特异抗体如PD-1联合EGFR/VEGF等、抗体偶联药物正在也进入了全新发展阶段（2）。
抗体生产工艺简介
抗体表达体系最常用的是CHO-K1细胞，国外发达国家药企单个发酵罐规模在10000L以上，而国内企业整体发酵规模较小，国内生物反应器规模普遍不超过2000L，表达量约5g/L。发酵技术提升带来表达量不断增加，目前Intensified Fed Batch方式生产表达量最高超过20g/L(3)。
随着上游培养规模越来越大，同时发酵液表达量不断攀升，上下游成本结构占比发生改变，下游从40%增加至60%以上，进而下游面临巨大成本压力。大多数商业抗体下游层析都采用平台化工艺：Protein A捕获--强阳离子交换填料中纯—强阴离子交换填料精纯。据统计，已上市的抗体以Protein A捕获工艺的产品约占70%。Protein A 亲和介质比普通纯化介质贵大约10倍，在抗体纯化成本中所占比重高于其他任何一个原材料，约占全部耗材成本的30%（4）。所以越来越多企业追求性价比更高，载量更高的Protein A介质。
UniMab 50HC 是一款高性能、耐碱型重组Protein A亲和层析介质。该填料以单分散多孔型聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微球为基质，其孔径经过特殊的设计，进一步增加比表面积。所以载量较上一代产品有50% 提升。具有高度的粒径均一性，并利用专有的表面亲水化修饰及功能化技术合成Protein A介质，耐碱性能好、机械强度高、回收率高、非特异性吸附低、HCP残留低、寿命长。
纳微 UniMab 50HC载量
UniMab 50HC与UniMab 50具有相同配基，它承袭了UniMab耐碱及高流速的优势，并且更高的载量满足了单抗表达水平不断的提高对填料载量的要求。在不同mAb上测试显示，新一代 UniMab 50HC的动态载量相比UniMab 50载量提高约50%。
实验设备、实验试剂：
设备： AKTA Explorer
色谱柱：某品牌/ UniMab 50HC (6.6x200cm)
样品：单抗发酵上清液（3~5mg/ml）
Buffer A ：PBS pH7.4
保留时间：4min
图1. UniMab 50HC载量对比图
纳微 UniMab 50HC耐碱
耐碱性对层析介质的使用次数及寿命至关重要。 UniMab 50HC采用了耐碱改造的rProtein A配基 ，通过环氧键与高度交联的聚丙烯酸酯基球偶联，骨架更稳定，配基不易脱落，可耐受0.5M的NaOH，很好的解决了层析介质CIP问题，使用寿命更长。如图所示， 在0.2M NaOH 80小时和0.5MNaOH 24小时条件下，UniMab 50HC对单抗动态结合载量下降均小于10%。连续纯化过程中，UniMab 50HC载量衰减亦较为缓慢，150次之后DBC下降小于10%。
图2. 0.2M NaOH 载量变化趋势
图3. 0.5M NaOH 载量变化趋势
某单抗HCCF寿命数据，每个循环中CIP碱接触时间1小时。
实验设备、实验试剂：
设备： AKTA Explorer
色谱柱：UniMab 50HC (6.6x200cm)
样品：单抗发酵上清液（3~5mg/ml）
Buffer A ：1M NaCI+磷酸盐，pH7.4
Buffer B ：磷酸盐， pH7.4
Buffer C ：醋酸，pH3.5
CIP：0.1M/每个cycle，1h +0.5M/每30 cycle,30min NaOH
保留时间：4min
图4. 某抗体项目中，UniMab 50HC载量衰减趋势
洗脱液 Protein A 脱落
配基脱落在单抗药物中有严格的规定，在最终的药物中Protein A的残留<10ppm。同时，配基脱落高，也会导致介质的寿命缩短。所以选择低Protein A的脱落，低残留的层析介质对抗体药物的质量控制以及工艺风险是非常关键的。
图5. 配基脱落统计
洗脱液宿主蛋白残留
纳微用于Protein A 介质的基球是通过多步表面亲水化改性，因此表面亲水性能好，非特异性吸附低，在抗体分离过程中，HCP去除效果好。一般来说聚合物基质的Protein A 因为亲水性问题，HCP 去除效果往往比软胶差，但UniMab可以达到软胶Protein A 的同等水平。如下图所示，在100次单抗寿命中，HCP残留在1000ppm左右。
图6. 宿主蛋白残留统计
洗脱液纯度
由于UniMab 50HC基质较为独特，所以对于一般单抗及双特异抗体的聚集体有更加良好的去除效果。在连续运行多次情况下，其去除聚集体能力依旧保持初始水平，如图7所示，某单抗寿命上显示，SEC纯度大于98。如图8所示，某双抗寿命上显示，纯度在96~99%波动，未见明显下降趋势。
图7. 单抗SEC统计
图8. 双抗SEC统计
UniMab 50HC优异压力流速特性
纳微Protein A 基球是高度交联的聚丙烯酸酯组成，与市场上软胶或低交联度聚丙烯酸酯为基质的Protein A 介质相比具有溶胀系数小，压缩比例低，而且具有优异机械性能，可以承受更高流速条件产生的压力，并装更高的柱床，有利于增加抗体批处理量，提高抗体生产效率，减少设备投资，提高设备利用率。
实验设备、实验试剂：
设备： AKTA Avant150
色谱柱：XK16/20, H=15cm
样品：单抗发酵上清液（3~5mg/ml）
Buffer A ：0.5M NaCl
温度：22℃
黄色：某国内品牌A 4%Agarose 绿色；某国外品牌B 6%Agarose
红色：某国外品牌C capto 蓝色：UniMab 50 紫色：UniMab 50 HC
UniMab 50HC在某抗体项目纯化效果
UniMab 50HC在某单抗的案列展示，经过UniMab 50HC可将大部分HCP及核酸等杂质有效去除，回收率大于90%。
实验设备、实验试剂：
设备： AKTA Avant150
色谱柱：UniMab50HC (XK16/20,14ml)
样品：某单抗发酵上清液（澄清过滤）
Buffer A ：20mM PB +150mM NaCl，pH7.3
Buffer B：50mM HAC,pH3.5
CIP： 0.5M NaOH
上样量：45mg/ml
保留时间：4min
图1.UniMab 50HC纯化层析图谱
总结
综上所述，UniMab 50HC是制药企业用于抗体药物生产非常不错的选择。表达量不断提升对下由填料提出更高要求，UniMab50HC载量更高，更加适合高表达量抗体纯化。在耐碱性上UniMab 50HC也是力压群胶，0.2M氢氧化钠室温25℃下80小时只有9%下降，预示着更长的使用寿命。0.1M氢氧化钠每次CIP条件下，可以使用超过150次以上，引领Protein A亲和填料耐碱第一梯队，减少了填料单次使用成本，进而大大降低了抗体生产成本。特殊基质使得UniMab 50HC在HCP聚集体去除效果上也有出众表现，同时低配基脱落也减少了异源蛋白进入病人体内造成副反应的风险。单分散特性的聚甲基丙烯酸微球赋予了UniMab 50HC极好的压力流速性能，非常适合更大直径层析柱放大生产，使用过程中无需担心压力过大造成碎胶问题。
参考文献:
1.Lin et al.Ab locks for improving the selectivity and safety of antibody drugs. Journal of Biomendical Science （2020） 27：76 https://doi.org/10.1186/s12929-020-00652-z.
2.Janice M.Reichert,PhD,The Antibody Society.
3.Weichang Zhou, Hang Zhou, Mingyue Fang and Siyuan Tang. Continuous Biomanufacturing Implementation: Using an Intensified and Integrated Bioprocess Platform. Monday, August 10, 2020.
4.Thompson R. Antibody therapeutics:product development,market trends,and strategic issues .2006 Oct.Available.
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